答疑专栏

(4)为什么PCR扩增的结果不理想?

时间:2018-05-10 来源:EASTWIN浏览次数:161

             问题诊断             
 
东东:  为什么PCR扩增的结果不理想,有的好,有的不好?

龙龙:这是个比较复杂的问题,影响因素比较多。有试剂的原因、有操作的原因、有程序的原因、有耗材的原因。就机器本身来说,可以从以下几个方面进行分析和解决。

1.   机器的温度不准确,偏差较大。大多发生于老旧机器,传感器损坏。只能返厂维修。

2.  温度均匀性不够。半导体制冷片部分失效导致。大多发生于老旧机器,但不排除个别新机器上也会发生,因为,半导体制冷器的寿命是无法准确预测的。建议返厂维修。

3.  PCR程序不是最优。如:PCR反应时间过短,导致反应不充分。在选择反应体系时,实际体系与选择的体系不符,导致实际热平衡时间延长,从而挤占了反应的时间,造成反应不充分,如50ul的试剂,选择了15ul反应体系。所以要仔细检查反应体系的选择,选择最接近实际的反应体系。

4.  PCR试管的形状与PCR仪Block上的孔的形状不贴合,有间隙,影响热传导,从而导致热平衡时间延长,或根本达不到反应温度,最终导致PCR反应效率降低。这是客户反应最多的问题之一,绝大部分原因是由于客户使用了不合格的试管耗材。不同厂家的PCR试管,其形状、锥度、管壁的厚薄、管壁的均匀性等相差很多,对实验结果有着直接影响。浙江杭州一高校购买了我们的ETC811PCR仪,可是老师反应实验结果就是不好,说温度有问题,机器返厂后检查温度,一切正常。机器返回实验室后,老师说实验的效果还是不好。无奈,我们的工程师上门检查,一看其所用的试管就知道问题出在了哪里。建议他们更换爱思进的耗材,实验的效果完全正常,老师恍然大悟。为此我们还专门研究了这种耗材的差别,如图所示:

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